摘要: 芸薹属(Brassica)蔬菜是我国栽培面积最大、总产量最高的一类蔬菜作物。其中白菜(Brassica　campestris L.ssp.chinensis Makino，syn.B.rapa ssp.chinensis)类蔬菜绝大部分属于冬性一年生蔬菜作物，需要经历一个低温阶段(春化作用)才能顺利完成阶段发... 展开 芸薹属(Brassica)蔬菜是我国栽培面积最大、总产量最高的一类蔬菜作物。其中白菜(Brassica　campestris L.ssp.chinensis Makino，syn.B.rapa ssp.chinensis)类蔬菜绝大部分属于冬性一年生蔬菜作物，需要经历一个低温阶段(春化作用)才能顺利完成阶段发育转变。感温先期抽薹是影响普通白菜(Brassica campestris ssp.chinensis var.communis)产量的一个重要因素，也是生产上迫切需要解决的问题。因而研究普通白菜的开花习性进而培育晚抽薹品种是解决这一问题的根本途径。菜心(B.campestris ssp.chinensis var.parachinensis)是白菜的一个变种，它对低温要求不严格，在华南地区可以周年生产，是代表极端早抽薹的一类白菜类作物。普通白菜和菜心具有相似的遗传背景，对春化需求却表现出巨大的差异，这为我们在白菜类蔬菜中研究春化作用提供了良好的材料。随着分子生物学理论和技术的发展，对同为十字花科的模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)春化作用的研究已经十分深入，这也为我们的研究提供了便利。本实验室在前一阶段实验中利用同源基因克隆法和RACE技术，从普通白菜和菜心中克隆到了拟南芥春化核心基因FLC的同源基因BcFLC-1和BcFLC-2，以及它们的内含子1序列。为进一步了解BcFLC基因的功能以及普通白菜与菜心对春化需求不同的原因，我们进而克隆了BcFLC的启动子序列，并构建了BcFLC基因的正义和反义载体，通过农杆菌介导的方法分别转入菜心和普通白菜中，得到了230株转化植株，分别对它们的开花时间进行观察。取得结果如下： (1)应用生物信息学软件对BcFLC-1与BcFLC-2基因编码区的核苷酸序列进行分析，发现两者编码序列的一致性高达99.34％，氨基酸序列包含与开花密切相关的MADS-盒结构域和K-盒结构域，仅在保守区域外存在1个氨基酸的差异。两者的内含子1序列的相似性达91.67％，启动子序列的相似性达97.1％，表明BcFLC-1和BcFLC-2并不存在实质性的差异。 (2)分别构建了正义BcFLC基因以及反义BcFLC基因的组成型启动子CaMV35S的表达载体pBI35S-BcFLC1和pBI35S-BcFLC2。检测鉴定后分别将它们导入农杆菌LBA4404菌株中。 (3)根据余小林等(2002)构建的菜心和普通白菜遗传转化体系，共获得48个芽系的230株抗卡那霉素抗性苗。其中转正义载体的菜心20个芽系，转化效率为3.608％，转空载体对照的菜心2个芽系，转化效率为1.831％，转反义载体的普通白菜18个芽系，转化效率为2.272％，转空载体对照的普通白菜2个芽系，转化效率为1.210％。以芽系为单位提取DNA，经PCR检测、Southern印迹杂交，所得到的再生植株中84.78％为阳性转基因植株。 (4)观察转基因菜心和普通白菜的开花时间发现，转入正义BcFLC基因表达载体的菜心平均在分化后54 d、长出10片真叶时现蕾，而对照转空载体的菜心平均在分化后的第45 d、8片真叶时现蕾。转入反义BcFLC基因表达载体的普通白菜与对照转空载体的普通白菜的开花时间差异明显。转基因普通白菜在无需春化的情况下，平均在分化后78 d、10片真叶时现蕾，继而抽薹开花，蕾期自交授粉后可正常结实。而对照植株不经春化作用，一直保持营养生长状态。 收起