摘要: 鱼类抗寒性状是鱼类的主要经济性状之一。虽然国内外学者对其做了大量的研究，但至今对淡水鱼类抗寒机理了解还很少。对于一些优良的喜温性鱼类，特别是生长在北方温带水域的品种，如何克服分布水域的限制，成为鱼类生物学家们面临的巨大挑战。近年来... 展开 鱼类抗寒性状是鱼类的主要经济性状之一。虽然国内外学者对其做了大量的研究，但至今对淡水鱼类抗寒机理了解还很少。对于一些优良的喜温性鱼类，特别是生长在北方温带水域的品种，如何克服分布水域的限制，成为鱼类生物学家们面临的巨大挑战。近年来，通过众多研究人员的不懈努力，鱼类对环境适应的相关研究已经取得了长足的进展。同时，在探讨鱼类适应环境温度机理方面，如形态学、生物化学、生态学、细胞遗传学及分子遗传学等学科也取得了若干进展，如对抗冻蛋白及其基因的研究、分子标记的应用、细胞膜的流动性、钙离子泵的差异、酯类代谢的差别、同工酶的差异、血液及血清学生化指标的变化、营养对鱼类抗寒力的影响等。另外，很多研究表明，冷驯化下许多鱼类基因的表达呈现上调趋势，这些基因主要包括细胞色素c氧化酶、细胞色素P450、抗冻蛋白基因、肉毒碱软脂转移酶Ⅰ、CDC48、Wap65等。但是，抗寒的确切遗传机理尚有待进一步研究。 本文利用抑制性消减杂交技术(SSH)，对鲤鱼(Cyprinuscarpio)抗寒性状相关的基因进行了分析研究。通过对荷包红鲤抗寒品系和柏氏鲤的杂交F2代进行降温诱导实验，获得不同温度下的实验材料。利用抑制消减杂交技术构建了各含有2000个克隆的正、反向消减cDNA文库。并对其中480个克隆进行斑点杂交筛选，共得到60个阳性克隆，选取其中29个克隆进行序列测定。通过序列分析比对，15个克隆与已知基因序列高度同源，同源性达到85％～98％，另外的14个克隆为未知新基因序列。与检测克隆同源性较高的基因包括brevican基因、AMP-acid连接酶基因、CFL2基因、催产素基因、主要组织兼容复合体(MHC)Ⅱβ链、锌指蛋白、细胞色素氧化酶、EPD-1基因、透明质酸结合蛋白多糖类、核受体/类视色素信号调节器、冷诱导RNA结合蛋白、翻译起始因子等。由此可见，鲤鱼在低温下由于受到冷刺激，其表达调控系统可能会导致某些基因的开启或关闭，从多个角度适应周围环境变化。神经系统的功能调控在鱼类抵抗低温的过程中也发挥着重要作用，如RNA冷诱导结合蛋白(Cirp)、脑室管膜蛋白(EPN)等的调控作用。EPN可以促进神经系统的再生，在鱼体冷驯化过程中具有重要意义。另外，AMP-acid连接酶多用于脂类转运、代谢过程，它可能参与了降温过程中细胞膜的脂类代谢，并改变了膜脂的组成，以维持膜的流动性和功能。这也表明，细胞膜的流动性与抗寒的关系非常密切。 另外，将所建立的正、反向消减cDNA文库中的所有菌落挑至硝酸纤维膜上，并用γ-32P标记的放射性同位素探针(CA)15进行杂交，筛选EST中的微卫星序列，共获得了21个含有微卫星的EST序列，其中核心序列为CA/GT的微卫星序列占绝大多数，另外也观测到GA、AT、CT等重复单元。利用PrimerPremier5.0对微卫星序列设计了9对特异性引物，并进行PCR检测。通过EST-SSR对柏氏鲤与荷包红鲤抗寒品系及其子代的分析表明，从EST中筛选到的微卫星标记与鲤鱼的抗寒性状或基因相关。并且，微卫星的不稳定性(MI)，即基因组中简单重复序列次数的增加或减少，也与基因的功能有关。实验结果表明，PCR扩增得到的微卫星片段核心序列重复次数小于134次(268/2)的子代不具备抗寒特性；而大于134次的个体具备抗寒能力。 根据鱼类抗寒问题的研究现状和今后发展趋势，开展鱼类抗寒基因的克隆鉴定及其耐寒机理研究，构建适于抗寒分析的实验鱼体系，筛选与抗寒功能相关的基因并研究其结构、功能及其表达调控机理，将为水产养殖鱼类培育抗寒优良品种提供大量的科学数据理论基础，有利于提高我国鱼类抗逆分子育种的研究水平及在国际鱼类养殖上的地位，这对于水产养殖业的可持续发展及扩大优良品种的养殖面积，提高人民的生活水平都具有重要的意义；同时，也具有巨大的经济价值、科研价值及广阔的应用前景。 收起