摘要: 动脉粥样硬化伴有血管内皮功能的受损,在经皮冠状动脉介入治疗中也存在血管内皮的剥脱损伤和修复不全.血管内皮损伤和修复不全,是引起血管平滑肌细胞迁移和增殖的主要原因之一,也是经皮冠脉介入治疗后支架内发生再狭窄的促发因素.现在有关防治再狭窄的... 展开 动脉粥样硬化伴有血管内皮功能的受损,在经皮冠状动脉介入治疗中也存在血管内皮的剥脱损伤和修复不全.血管内皮损伤和修复不全,是引起血管平滑肌细胞迁移和增殖的主要原因之一,也是经皮冠脉介入治疗后支架内发生再狭窄的促发因素.现在有关防治再狭窄的研究较多,其主要针对的靶点是抑制平滑肌细胞的迁移和增殖.血管内放射治疗和药物洗脱支架通过射线或抗细胞增殖药物作用,显示可以明显地抑制局部的血管平滑肌细胞过度增殖,在减少支架内再狭窄方面的效果较为显著,以雷帕霉素为代表的药物洗脱支架已经在临床上使用.但是,不管是血管内放射或者抗细胞增殖药物,其对细胞增殖的抑制都是非特异性的,这将引起经皮介入治疗后靶血管内皮修复不全,产生支架裸露、晚期支架内血栓形成等涉及远期安全性的担忧.在抑制血管平滑肌细胞增殖的同时,如果能促进血管内皮的修复,不但能减低介入治疗后再狭窄的发生率,对改善血管的重塑、促进其功能恢复也将有重要意义.一般认为损伤血管的内皮修复是由损伤邻近的内皮细胞增殖和迁移完成,但是血管损伤处周围的内皮细胞再生能力有限.随着近年来对干细胞研究的深入,发现骨髓来源的干细胞不但参与成年个体出生后的血管新生和血管形成,而且有可能对损伤血管的内皮修复也有重要作用.已经有研究确定外周血中存在骨髓来源的内皮前体细胞,称为内皮祖细胞(endothelial progenitor cell, EPC),EPC既能不断扩增,又能定向分化为成熟的内皮细胞.目前鉴定EPC的方法有细胞培养、免疫磁珠分选和荧光流式细胞检测法等;在进行双色荧光标记流式细胞检测时,CD34+AC133+或者CD34+VEGFR2+双阳性细胞比例基本可反映EPC的动态变化水平.正常生理状态下外周血中EPC数量很少,缺血、血管损伤等因素可以使外周血中EPC数量增加,推测其可能与损伤血管的修复过程增强有关.增强骨髓向外周血释放EPC的措施,称为骨髓动员.已经有报道将异体的骨髓干细胞进行扩增以后,输入血管损伤的动物模型,可以促进其损伤血管内皮的修复,但是药物和细胞因子等外源性因素能否通过自体骨髓动员增加外周血中EPC的数量,并促进损伤血管的内皮修复,尚未见更多的报道.如果能进一步揭示药物等外源性调节因素对在体EPC的作用环节和调控机理,必将为防治血管再狭窄和促进损伤血管修复提供研究基础.在冠心病的一级或二级预防中,他汀类药物都有显著的作用,除降低血中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平以外,还显示了改善血管内皮功能的效果;粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony-stimulating factor,G-CSF)则可增加外周血中各种前体细胞的数量,但是它们与循环中EPC的关系还知之甚少.该实验拟在小鼠下肢缺血的基础上给予辛伐他汀和G-CSF刺激,初步了解外周血中EPC数量的动态改变;然后在大鼠球囊损伤血管模型上采取类似的干预手段,观察对损伤血管内皮修复和新生内膜增殖效应的影响.方法:1.小鼠下肢缺血及他汀药物和细胞因子对外周血EPC的影响:参考文献介绍的方法建立小鼠下肢缺血模型,再单独或联合给予辛伐他汀和G-CSF等药物进行骨髓动员,术前、术后3天和术后7天等不同的时间点取血,行外周血白细胞记数以了解骨髓动员的程度,同时进行外周血双色荧光标记流式细胞检测,测定CD34+VEGFR2+的比例,以反映在缺血及加用药物刺激的情况下外周血EPC的变化水平.2.大鼠颈动脉球囊损伤模型建立及新生内膜形成观察:用Forgaty球囊导管制备大鼠颈动脉内皮剥脱损伤模型,扫描电镜观察内皮剥脱效果.然后给予前述干预药物,术后2周取血管行石腊切片HE染色和PCNA免疫组化染色观察有无新生内膜增生及增生程度.3.大鼠颈动脉球囊损伤及药物和细胞因子干预后外周血CD34阳性细胞比例观察:术后2周各组取外周血进行荧光标记流式细胞测定,了解CD34阳性细胞的比例,间接反映骨髓动员程度和外周血中EPC变化水平.4.大鼠颈动脉球囊损伤及药物和细胞因子干预后血管内皮修复观察:术后4周注射伊文氏蓝评价血管内皮修复程度,同时测定血管环的最大舒张率和血管匀浆释放NO的水平,以比较各组动物经药物干预以后血管修复程度的功能差别.结果:1.小鼠下肢缺血及药物干预后骨髓动员程度和外周血EPC的变化:与对照组比较,缺血后小鼠外周血CD34和VEGFR2双阳性细胞比例有轻度的增加;与单纯缺血组相比,给予辛伐他汀对外周血白细胞数量没有显著的影响,给予辛伐他汀后CD34和VEGFR2双阳性细胞比例较单纯缺血组增加;同时给予辛伐他汀和G-CSF后不但使外周血白细胞数量明显增加,而且CD34和VEGFR2双阳性细胞比例也显著增高,提示药物和细胞因子等外源性刺激因素可以使骨髓动员增强,从而使外周血中EPC数量增加.各个时相点中,CD34和VEGFR2双阳性细胞比例以术后2周增加最明显,反应外周血中EPC的数量变化有时间依赖性.2.大鼠颈动脉球囊损伤模型建立结果:大鼠颈动脉经球囊损伤后,扫描电镜观察证实有明显血管内皮剥脱.在单纯球囊损伤组,损伤后2周石腊切片HE染色见明显的新生内膜增殖,血管腔明显变狭窄.经PCNA组化染色发现中膜和新生内膜有较多PCNA阳性细胞,反映其中以平滑肌细胞为主的细胞成分增殖明显.3.药物和细胞因子干预对新生内膜增生程度的影响:经辛伐他汀或G-CSF干预后,损伤血管的新生内膜增殖减轻,中膜和新生内膜中PCNA阳性细胞比例减低,代表新生内膜增生程度的内膜/中膜比值减小,其中以辛伐他汀合并G-CSF使用的效果最明显,提示药物干预有抑制大鼠球囊损伤后新生内膜增殖的效果. 4.药物和细胞因子干预对损伤血管功能的影响:手术后4周,与单纯球囊损伤组比较,损伤血管经药物干预后在血管环张力实验中表现出最大舒张率改善,血管匀浆释放NO的水平增加,提示经药物干预可以促进损伤血管的内皮修复,内皮依赖性血管功能得到明显改善.5.外周血EPC与血管内皮修复的关系:单独给予辛伐他汀及合用辛伐他汀和G-CSF的两组大鼠,外周血中经荧光标记流式细胞检测CD34阳性细胞比例增加,在合用辛伐他汀和G-CSF组,CD34阳性细胞比例增加更明显,同时损伤血管新生内膜增殖程度更轻.提示外周血中EPC可能参与损伤血管的内皮修复,而且其增加的水平与修复程度相关.结论:1.正常生理状态下,外周血中存在极少量的EPC,骨髓动员可以增加外周血中EPC的数量,骨髓动员的程度和外周血中EPC升高的水平有关.2.外周血中EPC参与损伤后血管的修复过程.外源性药物动员骨髓使外周血中的EPC数量增加,可以促进球囊损伤血管的内皮修复和减轻新生内膜增生程度.3.骨髓动员后外周血EPC水平增加程度与血管损伤后修复程度有关. 收起