摘要: 该文以自筛选出的具有一定不对称转化生成(S)-酮基布洛芬能力的芽孢杆菌为材料,对此菌株的培养条件,全细胞体系的转化条件以及该菌株细胞中脂肪酶的分布、性质、分离纯化后不对称转化能力的变化等方面进行了研究.实验结果表明,利用疏水层析柱-凝胶过滤... 展开 该文以自筛选出的具有一定不对称转化生成(S)-酮基布洛芬能力的芽孢杆菌为材料,对此菌株的培养条件,全细胞体系的转化条件以及该菌株细胞中脂肪酶的分布、性质、分离纯化后不对称转化能力的变化等方面进行了研究.实验结果表明,利用疏水层析柱-凝胶过滤层析柱分离纯化该菌细胞中的脂肪酶,活性峰酶的比活提高了61.7倍;其中23kDa蛋白纯度提高400倍以上.结果说明此层析技术对从细菌细胞直接提取的粗酶中,获得较难分离的低丰度脂肪酶来说是一种快速、实用而有效的纯化手段.纯化后的脂肪酶以乙酸对硝基苯酯和酮基布洛芬氯乙酯为底物表现出与全细胞体系相一致的脂肪酶水解活性.在构建的PBS-溶菌酶-石英砂提取转化体系中,24、48、72小时粗酶的转化率相差不大,但24小时的(S)-对映体过量最高,达到6.18%.疏水层析后酶活高峰合并组分各时间段转化率也无明显差异,(S)-对映体过量仍以24小时最高,为18.9%.凝胶过滤后所得的酶活高峰各管尽管蛋白种类不同,但也都具有不对称拆分获得(S)-酮基布洛芬的能力.其中第15号管中经SDS-PAGE检测仅见23kDa的单一蛋白带,(S)-对映体过量高达52.0%.说明13号菌中具有不对称拆分能力的脂肪酶不止一种;此结果为揭示细菌中脂肪酶不对称拆分的本质具有非常重要的意义.利用ESI-QUAD-TOF质谱分析23kDa脂肪酶.在蛋白质数据库MSDB中比对质谱得到的肽序列标签,没有发现与23kDa蛋白匹配的已知蛋白.因此,可确定该实验获得的23kDa蛋白为一种未知蛋白.从其它数据库(Swiss-Prot/TrEMBL,PROSITE)搜索及分析也发现,肽序列标签中没有与已知脂肪酶或酯酶相同的序列;而且也未在其中发现芽孢杆菌脂肪酶的保守序列Gly/Ala-X<,1>-Ser-X<,2>-Gly.考虑到质谱分析所得肽序列标签只是蛋白全序列的一部分,因此,估计保守序列在未被分析的氨基酸序列之中.13号菌中23kDa脂肪酶质谱分析的结果,为最终构建具有特异性拆分2-芳基丙酸类药物能力的工程菌奠定了基础. 收起