摘要: 该研究制备获得了针对SLT-ⅡeA亚单位的单克隆抗体,利用实验室现有的SLT-ⅡeA亚单位重组表达菌pSLT-ⅡeA在2×YTA培养后,经IPTG诱导表达融合蛋白GST-SLT-ⅡeA,经谷胱苷肽活化的Sepharose 4B亲和层析柱提纯后测定浓度,作为免疫原免疫BALB/c小鼠.经诱导表... 展开 该研究制备获得了针对SLT-ⅡeA亚单位的单克隆抗体,利用实验室现有的SLT-ⅡeA亚单位重组表达菌pSLT-ⅡeA在2×YTA培养后,经IPTG诱导表达融合蛋白GST-SLT-ⅡeA,经谷胱苷肽活化的Sepharose 4B亲和层析柱提纯后测定浓度,作为免疫原免疫BALB/c小鼠.经诱导表达融合蛋白的重组菌、未经诱导不表达融合蛋白的重组菌及仅表达载体蛋白GST的重组菌三者的裂解产物包被ELISA板,细胞融合后培养基上清经检测获得1株针对SLT-Ⅱe A亚单位的杂交瘤细胞,命名为A<,2>-D<,3>,制备的单抗腹水ELISA效价为24log2,免疫印迹结果表明此单抗仅与融合蛋白反应,而与载体蛋白不反应.利用此单抗经Western-blotting检测13个水肿病菌株,发现均产生志贺样毒素Ⅱ型变异体.用PCR技术对F107/86标准株扩增F18ab菌毛主要亚单位A(FedA)的510bp的基因序列(fedA),并将PCR扩增片段在EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点克隆进pGEX-6P-1质粒载体,获得重组质粒pE107,将此质粒转化大肠杆菌BL21,诱导表达融合蛋白GST-F107.利用EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点将SLT-ⅡeA基因序列从已有的重组表达质粒pSLT-ⅡeA中切出亚克隆入pF107下游,获得重组表达质粒pFSLT-ⅡeA,转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达,通过对重组大肠杆菌pFSLT-ⅡeA的菌体裂解物的SDS-PAGE电泳分析及Western-blotting鉴定,表明重组菌正确表达了F18ab菌毛A亚单位和SLT-ⅡeA亚单位的联合表达产物.为了研究联合表达产物的免疫学特性,我们用ICR小鼠进行了免疫原性试验.已诱导表达后的重组菌菌体裂解物乳化后两次免疫小鼠,二次免疫后8天眶静脉采血做ELISA,检测抗体效价,同时设立pSLT-ⅡeA、pF107重组菌诱导表达产物的对照组.结果表明:该重组菌能有效对小鼠进行保护,保护率达到7/8. 收起