摘要: 目的:构建石英谐振式基因传感器阵列检测系统,以链延伸技术及肽核酸探针两种方法提高传感器阵列检测灵敏度,并探索对临床标本进行直接检测的可行性.方法:1.首先利用精细微加工法制作单个石英谐振式传感器,并在其两面光刻出金膜电极,比较了不同电极厚度... 展开 目的:构建石英谐振式基因传感器阵列检测系统,以链延伸技术及肽核酸探针两种方法提高传感器阵列检测灵敏度,并探索对临床标本进行直接检测的可行性.方法:1.首先利用精细微加工法制作单个石英谐振式传感器,并在其两面光刻出金膜电极,比较了不同电极厚度及直径对基因杂交检测的影响.在此基础上先后构建了粘胶式2×5型传感器阵列以及夹具式2×5型传感器阵列.并自行开发研制自激式振荡电路、PESAV2.0版频率记录分析软件.将它们与计算机联用以构建石英谐振式基因传感器阵列检测系统.2.分别用巯基固定法及生物素-亲和素固定法将人类乳头瘤病毒的探针固定在基因传感器阵列的金膜表面,并具体比较了两种方法的优劣.3.基因传感器阵列表面分别固定上金黄色葡萄球菌mecA及femA两种探针片段,待杂交上相应的靶序列片段后,加入Klenow酶在室温下进行链延伸反应.4.在传感器阵列表面固定上HBV的bis-PNA探针,并具体摸索了bis-PNA探针与HBV基因组DNA杂交时的最佳pH值、最佳离子浓度、最佳探针固定量、以及靶序列结合量对频率下降值的影响,并对靶序列量和对应频率下降值的关系进行了线性回归处理.结论: 1.夹具式2×5型传感器阵列在液相中振荡时稳定性更高. 2.自激式振荡电路对石英谐振式基因传感器阵列的液相振荡进行了特别的优化,使传感器阵列能够在液相中更稳定地工作. 3."PESAV2.0"应用软件是一类可实时记录与分析石英晶体谐振频率的新型实用性软件. 4.将上述组件组合在一起所构建出的第三代检测系统为后续实验搭建了一个坚实的技术平台,相信也可以为临床上病原性微生物的检测以及多种疾病的早期诊断提供一种与常规的检测方法完全不同的新方法.5. 两种探针固定方法均能有效地将探针固定在石英谐振式传感器阵列金膜表面.两种方法各有优缺点,具体采用何种方法固定基因探针,还得根据具体的情况进行详尽的分析. 6.链延伸反应成功地将传感器的检测灵敏度从0.5nM提高到0.05nM.使临床上痕量DNA的检测成为可能.但反应耗时较长、影响因素较多、且无法对基因组DNA进行直接检测. 7.弱酸性的杂交环境(pH6.8)对bis-PNA和HBVdsDNA杂交反应的顺利进行至关重要.实验结果从另一个角度证实了bis-PNA和由DNA杂交过程中"Hoogsteen链第一"的观点. 8.离子浓度也极大地影响了杂交反应的时间,低盐离子浓度更有利于提高bis-PNA和dsDNA的杂交速率,高盐离子浓度则会大大降低biS-PNA的结合速率. 9.1.5μM bis-PNA探针固定浓度最为适宜.而杂交反应引起的频率下降值随靶序列浓度的升高呈先升后趋于缓和的典型饱和曲线趋势. 10.以设计的bis-PNA探针实现了对临床标本中HBV基因组DNA的直接检测,而且标本DNA的浓度范围正好在传感器检测的线性范围之内.因此,石英谐振式传感器阵列检测系统的成功构建为定量检测临床标本中的HBV含量搭建了一个很好的技术平台. 收起