摘要: 原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)是精子或卵子的祖先细胞，是一种多能干细胞。由于原始生殖细胞可以直接将外源基因传给后代，故以其作为转基因载体生产转基因鸡具有广阔的前景。体外分离培养PGCs，并对其进行遗传操作，再将整合有外源基因... 展开 原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)是精子或卵子的祖先细胞，是一种多能干细胞。由于原始生殖细胞可以直接将外源基因传给后代，故以其作为转基因载体生产转基因鸡具有广阔的前景。体外分离培养PGCs，并对其进行遗传操作，再将整合有外源基因的PGCs重新注入鸡胚血管中，就可获得性腺嵌合体，生产出稳定遗传的转基因后代。 本实验从孵化5.5d的伊萨鸡胚生殖嵴中分离原始生殖细胞，经Ficoll密度梯度离心纯化PGCs细胞，通过PAS(过碘酸希夫试剂)和AKP(碱性磷酸酶)染色鉴定，其纯度可达70％。同时分离孵化5.5d的鸡胚性腺基质细胞作为饲养层，在添加多种生长因子(白血病抑制因子mLIF、成纤维细胞生长因子bFGF、白介素-11 IL-11、胰岛素样生长因子hlGF-Ⅰ、干细胞生长因子hSCF)的条件下培养PGCs细胞，探索其体外培养的最佳条件。 本实验构建了pLenti6-eGFP慢病毒表达载体，与辅助质粒共转染293FT细胞生产病毒颗粒。将慢病毒浓缩后转染鸡胚PGCs，转染率高达24.19％。通过显微注射的方法，将转染外源基因的PGCs供体细胞，浓缩后注入孵化2.5d的受体鸡胚血液中，接受了供体PGCs细胞的受体鸡胚继续孵化至第8d。之后提取受体鸡胚基因组DNA进行PCR检测，结果显示：在检测的42只受体鸡胚中，有2只发生性腺嵌合，嵌合率为4.8％。 本研究建立了分离PGCs、体外培养PGCs、制备嵌合体的方法，不仅可以提供丰富的供体细胞来源，还为转基因鸡的成功制备创造条件。 收起