摘要: 文昌鱼(Amphioxus)是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型，是研究动物进化和胚胎发育的典型材料。利用分子生物学手段，研究文昌鱼有关基因的结构、进化和表达，可以揭示文昌鱼发育的分子生物学机制，有助于我们从分子水平上来了解脊椎动物的起源... 展开 文昌鱼(Amphioxus)是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型，是研究动物进化和胚胎发育的典型材料。利用分子生物学手段，研究文昌鱼有关基因的结构、进化和表达，可以揭示文昌鱼发育的分子生物学机制，有助于我们从分子水平上来了解脊椎动物的起源和进化。本文从青岛文昌鱼(Branchiostomabelcheritsingtauense)肠cDNA文库(本实验室保存)中，克隆了具有完整编码框的钙结合蛋白基因——钙调素1基因(AmphiCaMla和AmphiCaMlb)、AmphiCalbin基因和钙相关蛋白基因(AmphiCaRP1和．AmphiCaRP2)，并对其结构、进化和表达分别开展了研究。 本文从青岛文昌鱼的肠cDNA文库中得到两个编码CaMl蛋白的CaMl基因，命名为AmphiCaMla和AmphiCaMlb。二者开放阅读框内仅有两个核苷酸突变，其中一个造成一个氨基酸突变，这一点已经通过半巢式PCR扩增在基因组水平上得到验证。系统进化分析表明，三种文昌鱼的CaMl是传统的钙调素基因，CaM2也许是CaMl基因倍增的产物。Southern杂交结果进一步表明CaMl基因在青岛文昌鱼基因组中存在两个拷贝。Northern杂交结果显示，AmphiCaMla基因在文昌鱼中存在两个转录本。整体原位杂交、切片原位杂交和Northern杂交结果一致表明从晚期神经胚一直到成体阶段，AmphiCaMla基因在消化系统强烈表达并一直持续到成体。这提示在神经胚期结束后，AmphiCaMla基因参与了文昌鱼消化系统的发育和行使功能，并且性成熟后在性腺也发挥一定的作用。作为现存的最接近于脊椎动物祖先的无脊椎动物，头索动物文昌鱼中两个CaMl基因的存在及其表达模式的研究尚属首次报道。 第三个从青岛文昌鱼肠cDNA文库中克隆到的是编码新型EF手形钙结合蛋白(EFCaBPs)的AmphiCalbin基因。系统进化分析得到了两个有趣的推论。首先，AmphiCalbin与一大组至今未命名的EFCaBPs聚类在一支，而与已鉴定的EFCaBPs分离开来。其次，AmphiCalbin落在了脊椎动物未命名的EFCaBPs-支的基部，很可能代表了它们的原型。这一观点从我们分析的基因组结构上也得到了支持，AmphiCalbin与其脊椎动物的同源基因有着一致的外显子-内含子结构组成。切片原位杂交和整体原位杂交结果一致显示了AmphiCalbin基因在消化系统和性腺的组织特异性表达模式。这提示AmphiCalbin基因可能在消化系统和性腺发挥重要的作用，可以为我们进一步了解未命名．EFCaBPs基因家族的表达模式奠定基础。本文报道的最后两个从青岛文昌鱼肠cDNA文库中克隆到的基因是编码钙相关蛋白的AmphiCaRP1和AmphiCaRP2基因。序列与系统进化分析显示，AmphiCaRP1和．AmphiCaRP2是钙结合蛋白家族的新成员，无EF手形结构，二者聚类在一起。RT-PCR分析表明，AmphiCaRP1和AmphiCaRP2基因在文昌鱼成体的各个组织都表达，在肝盲囊表达丰度略高，提示AmphiCaRPl和AmphiCaRP2可能都与文昌鱼的消化功能有关。整体原位杂交结果表明，AmphiCaRP1基因在胚胎发育到两天的时候才开始在消化系统表达，而AmphiCaRP2基因在胚胎发育到一天的时候就开始在消化系统表达，这提示对于文昌鱼幼虫，AmphiCaRP2比AmphiCaRP1更早发挥其在消化系统的生理功能作用。 收起