摘要 : 目的 通过体内基因阻断和体外酶促反应鉴定可利霉素产生菌中糖基转移酶基因 ssp803 功能和酶学特性,以及与可利霉素生物合成的关系.方法 在可利霉素产生菌 54-IA 中利用 CRISPR-Cas9 基因编辑系统敲除 ssp803 基因,将组成型启动子 kasOp* 控制的 ssp8... 展开 目的 通过体内基因阻断和体外酶促反应鉴定可利霉素产生菌中糖基转移酶基因 ssp803 功能和酶学特性,以及与可利霉素生物合成的关系.方法 在可利霉素产生菌 54-IA 中利用 CRISPR-Cas9 基因编辑系统敲除 ssp803 基因,将组成型启动子 kasOp* 控制的 ssp803 及其同源基因 oleD 分别转化到 54-IA 和∆803 变株中进行回复和高表达实验,通过 HPLC 分析∆803 变株、回复株和高表达株中可利霉素主组分异戊酰螺旋霉素的产量变化.再将 ssp803 基因连接至冷休克表达载体 pColdI 上,利用大肠杆菌 Transetta(DE3)中进行表达和纯化.以大环内酯类抗生素为糖苷配体和以 UDP-葡萄糖为供体进行 Ssp803 催化反应,通过 HPLC-MS 检测酶催化后的产物,通过 UDP-Glo 试剂盒测定 Ssp803 的酶促动力学参数.结果 利用 PCR 筛选出了 ssp803 基因框内缺失突变株∆803,在 ∆803 中异戊酰螺旋霉素产量与 54-IA 出发菌株相似,而在 54-IA 和 ∆803 中高表达 ssp803 完整基因时,异戊酰螺旋霉素的含量明显下降,导入高表达 oleD 基因的质粒后产量下降得更多.通过体外酶促反应证实 Ssp803 催化的最适温度是 37℃,最适 pH 是 9.06.Ssp803 对所测的大环内酯类抗生素都具有糖基化失活作用,对异戊酰螺旋霉素 I 等 16 元环的大环内酯类抗生素的催化活性要低于14 元环大环内酯类抗生素,对索利霉素的催化效率最高.结论 Ssp803 对大环内酯类抗生素具有糖基化失活作用,对 14 元环大环内酯类抗生素的活性更高,最适底物是索利霉素;在可利霉素产生菌中高表达 ssp803 和 oleD 基因会抑制异戊酰螺旋霉素的生物合成. 收起