摘要 : 目的 探索利用磁珠提取法结合实时荧光定量核酸扩增技术,建立定量测定毕赤酵母来源重组人血白蛋白中残留DNA的方法.方法 将蛋白裂解后采用磁珠提取法提取样品中的残留DNA,利用Taqman探针法对样品和DNA标准品进行定量PCR测定,根据标准曲线对样品中的DN... 展开 目的 探索利用磁珠提取法结合实时荧光定量核酸扩增技术,建立定量测定毕赤酵母来源重组人血白蛋白中残留DNA的方法.方法 将蛋白裂解后采用磁珠提取法提取样品中的残留DNA,利用Taqman探针法对样品和DNA标准品进行定量PCR测定,根据标准曲线对样品中的DNA残留量进行分析.采用重组人血白蛋白和血浆来源人血白蛋白2种基质对建立的方法进行回收率和重复性测定,评价方法准确性及精密度,并测定毕赤酵母来源重组人血白蛋白产品中残留DNA含量.结果 该方法测定毕赤酵母DNA残留最低准确定量浓度为3fg· μL-1,DNA含量在3 fg· μL-1 ～300pg· μL-1内曲线线性良好,标准曲线相关系数r2为0.998 3;以重组人血白蛋白作为基质时,100和10fg·μL-1 DNA加标回收率均值分别为93.58％(n=4)和215.56％(n=4);相对标准偏差RSD分别为19.6％及42.9％;以人血白蛋白作为基质时,100和10 fg·μL-1DNA加标回收率均值分别为67.09％(n=3)和113.40％(n=3);相对标准偏差RSD分别为6.9％和11.1％.按该方法检测毕赤酵母来源的3批重组人血白蛋白DNA残留量均值(n=7)分别为5.98、4.16和4.49 fg·μL-1 (n =7);3批样品DNA残留量均小于1ng· 10 g(Pro)-1.结论 磁珠分离法结合荧光定量PCR方法可解决超高蛋白浓度背景下重组人血白蛋白痕迹量DNA定量测定的技术难题,准确性和重现性良好,可以用于重组人血白蛋白毕赤酵母DNA残留量的定量检测. 收起